Skip to content

Podpisy autoprzeciwciał w raku prostaty cd

4 tygodnie ago

508 words

Wektory fuzyjne T7 zostały następnie zapakowane w fagi T7 w celu wytworzenia biblioteki fagowej cDNA T7 dla raka prostaty. Aby wzbogacić bibliotekę klonami peptydów reagującymi z surowicą ludzką od pacjentów z klinicznie zlokalizowanym rakiem gruczołu krokowego, a nie surowicą od kontroli, przeprowadzono kilka cykli selekcji powinowactwa (biopanning). W skrócie, biblioteki fagowe wstępnie adsorbowano na oczyszczonych IgG z puli kontrolnej próbek surowicy (od 10 pacjentów) w celu usunięcia niespecyficznych klonów. Następnie, wstępnie oczyszczone biblioteki fagowe wzbogacono o specyficzne dla nowotworu peptydy z użyciem puli IgG oczyszczonej z surowicy 19 pacjentów z rakiem prostaty. Związane fagi wymywano i namnażano przez infekowanie komórek bakteryjnych. Po pięciu rundach biopanningu, wzbogacone klony peptydowe specyficzne dla raka gruczołu krokowego hodowano na płytkach agarowych LB. Łącznie 2304 pojedynczych kolonii, w tym puste klony fagowe T7 jako plamy ujemne i antyludzkie IgG jako plamy pozytywne, losowo zebrano i namnożono na 96-studzienkowe płytki. Następnie lizowano lizaty klonów na powleczonych szklanych szkiełkach za pomocą zrobotyzowanego wskaźnika do tworzenia mikromacierzy fagowo-białkowej. Przeciwciało anty-ludzkie znakowane Cy5 (czerwoną fluorescencyjną barwnik) zastosowano do wykrywania IgG w surowicy ludzkiej, które były reaktywne wobec klonów peptydowych, i znakowano przeciwciała znakowane Cy3 (barwnik fluorescencyjny), w celu wykrycia białka kapsydu faga w celu znormalizowania pod kątem plamienia. . Tak więc, jeśli klon fagowy przenosi peptyd reaktywny względem ludzkiej IgG, po skanowaniu plamka ta będzie żółta; w przeciwnym razie plama pozostanie zielona, reprezentując niereaktywny klon. Łącznie 31 próbek (20 od pacjentów z rakiem i 11 od kontroli) przetestowano na 2304 mikromacierzy faga-peptyd. Analiza tych 31 próbek pozwoliła zidentyfikować 186 peptydów fagowych o najwyższym poziomie zróżnicowania nowotworów i kontroli, które następnie wykorzystano do opracowania skoncentrowanych mikromacierzy do analiz w kolejnych fazach szkolenia i walidacji. Poprzez iteracyjne biopanningowanie (patrz słowniczek) biblioteki prezentacji fagowej pochodzącej z tkanek raka gruczołu krokowego opracowaliśmy mikromacierze białek fagowych i wykorzystaliśmy je do opracowania sygnatury autoprzeciwciał, aby odróżnić próbki z rakiem prostaty od próbek kontrolnych. Szczegóły dotyczące budowy bibliotek fagowych i przygotowania mikromacierzy fagowo-białkowych podano w Dodatkowym dodatku i pokazano na rysunku 1.
Analiza statystyczna
Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą oprogramowania SPSS, wersja 11.5 i R 2.0. Szczegóły podano w Dodatkowym dodatku.
Wyniki
Opracowanie mikromacierzy z fagami-białkami (faza odkrywania)
Aby opracować bibliotekę fagową peptydów raka prostaty, wyizolowaliśmy matrycowy RNA (mRNA) z tkanki raka prostaty uzyskany od sześciu pacjentów z klinicznie zlokalizowaną chorobą (Tabela Dodatkowego Dodatku). Po wstawieniu komplementarnych fragmentów DNA (cDNA) do układu faga T7, peptydy kodowane przez cDNA raka gruczołu krokowego ulegały ekspresji i były wyświetlane na powierzchni faga połączonego z C-końcem białka kapsydu 10B faga. . Ten kompleks powierzchni funkcjonował jako przynęta do wychwytywania autoprzeciwciał w surowicy.
Próbki surowicy od 39 pacjentów z rakiem prostaty i 21 kontrolami wybrano losowo z kohort surowicy Uniwersytetu Michigan w fazie odkrywania
[patrz też: obrażenia po wypadku samochodowym, densytometria cena badania, choroba raynauda leczenie ]
[przypisy: stomatolog białystok cennik, choroba raynauda leczenie, co to są choroby genetyczne ]