Skip to content

Mutacje w regionie Precore regionu wirusa zapalenia wątroby typu B u pacjentów z ciężkim i ciężkim zapaleniem wątroby cd

5 dni ago

506 words

Próbki ogrzewano w 95 ° C przez pięć minut (w celu denaturacji DNA), ochłodzono do 55 ° C przez dwie minuty (w celu przyłączenia starterów do matrycowego DNA) i ogrzewano do 70 ° C przez dwie minuty (w celu aktywacji enzymu i przedłużyć wyżarzane startery). Etapy te powtórzono dla 30 do 50 cykli. Zaczynając od drugiego cyklu próbki ogrzewano w 95 ° C przez dwie minuty. Po ostatnim cyklu wszystkie próbki inkubowano przez dodatkowe pięć minut w temperaturze 70 ° C, aby zapewnić zakończenie końcowego etapu wydłużania. Po ostatnim etapie amplifikacji każdą 10-.l próbkę naniesiono na 8-procentowy żel akryloamidowy lub na złożony żel 3% Nusieve (FMC Bioproducts, Rockland, Me.) Zmieszany z 1% agarozą Seakem (FMC Bioproducts) w TRIS Bufor borowodorowy (pH 8,0) i poddany elektroforezie obok DNA pBR322 trawionego AluI jako znacznik wielkości molekularnej. Po elektroforezie żele wybarwiono bromkiem etydyny na 10 minut i obserwowano w świetle ultrafioletowym. Przeprowadzono hybrydyzację typu Southerna, jak opisano w innym miejscu 14, w celu potwierdzenia obecności sekwencji homologicznej w zamplifikowanym produkcie.
W celu bezpośredniego sekwencjonowania części DNA HBV, produkty PCR odwirowano w mikrokoncentratorze (Centricon 30, Amicon, Danvers, MA). Sekwencja została określona zgodnie z modyfikacją procedury Sangera i wsp.17. Aby sekwencyjnie zsekwencjonować zamplifikowany segment, przygotowaliśmy dwa startery oligonukleotydowe: nukleotydy 1774 do 1792 (5 TAGGAGGCTGTAGGCATAA3 ) i nukleotydy 1916 do 1932 (5-GCTCCAAATTCTTTATA3 ). Jeden starter do sekwencjonowania był znakowany radioaktywnie za pomocą kinazy polinukleotydowej [32P] ATP i T4 (Fig. 1). Po oczyszczeniu w mikrokoncentratorze, do 10 pmoli produktu PCR i 5 pmola znakowanego 32P startera do sekwencjonowania połączono w 12 .l mieszaniny składającej się z 50 mM chlorku potasu, 50 mM TRIS (pH 8,0), 5 mM chlorku magnezu, i 10 mM ditiotreitolu. Bezpośrednie sekwencjonowanie produktów PCR przeprowadzono w sposób opisany wcześniej18
Wykrywanie RNA wirusa zapalenia wątroby typu C.
Aby wykluczyć możliwość nadkażenia wirusem zapalenia wątroby typu C u pacjentów ze śmiertelnym zapaleniem wątroby, RNA ekstrahowano z ml surowicy, a obecność lub brak RNA wirusa zapalenia wątroby typu C określono za pomocą PCR, jak opisano wcześniej.19
Wyniki
Wykrywanie markerów HBV
Test na HBeAg surowicy lub anty-HBe był silnie pozytywny tylko u jednego z pięciu pacjentów z piorunującym zapaleniem wątroby (Pacjent 5) (Tabela 1). Dla kontrastu, wszyscy czterej pacjenci ze śmiertelnymi zaostrzeniami przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby typu B byli dodatni pod względem anty-HBe.
Spośród dziewięciu pacjentów ze śmiertelnym zapaleniem wątroby test na obecność IgM anty-HBc był silnie pozytywny u wszystkich pięciu pacjentów z piorunującym zapaleniem wątroby. Co więcej, w trakcie ich choroby, dwóch z czterech pacjentów ze śmiertelnymi zaostrzeniami przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby typu B przeszło od ujemnego do dodatniego (Tabela 1). DNA HBV nie został wykryty techniką hybrydyzacji punktowej u żadnego z 5 pacjentów z piorunującym zapaleniem wątroby (tabela 1) lub u 10 pacjentów z ostrym, samoograniczającym się zapaleniem wątroby. Przeciwnie, wykryto go u wszystkich czterech pacjentów z ciężkim zaostrzeniem przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby typu B (tab. 1)
[podobne: przychodnia eskulap, testosteron cena, ułożenia rtg ]