Skip to content

Mutacje w regionie Precore regionu wirusa zapalenia wątroby typu B u pacjentów z ciężkim i ciężkim zapaleniem wątroby ad

5 dni ago

564 words

Ci pacjenci mieli wysokie poziomy aminotransferazy asparaginianowej w surowicy (średnia, 8,86 .mol na sekundę na litr) i byli seropozytywni dla HBsAg i anty-HBc IgM. Próbki biopsji wątroby pobrano od 7 z tych 10 pacjentów i miały typowe cechy patologiczne ostrego zapalenia wątroby. Wszyscy ci pacjenci szybko wyzdrowali, a HBsAg usunął się z surowicy. Aby ustalić, czy istniała mutacja regionu pierwotnego DNA HBV u pięciu pacjentów z nieinfekcyjnym ostrym zapaleniem wątroby typu B, uzyskano dwie próbki od każdego pacjenta, jedno pobrane podczas fazy HBeAg-dodatniej i jedno podczas fazy anty-HBe-dodatniej. Te pięć par próbek uzyskano średnio w odstępie 28 dni (minimum, 16 dni, maksimum, 42 dni). U pozostałych pięciu pacjentów próbki surowicy były już ujemne dla HBeAg, gdy były badane. Tak więc, tylko jedna próbka została zbadana dla tych pięciu pacjentów. Serologiczna analiza markerów wirusowych zapalenia wątroby
Przeciwciała HBsAg, HBeAg i anty-HBe, IgM przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu A i przeciwciało przeciwko antygenowi delta testowano za pomocą testów radioimmunologicznych w fazie stałej (zestaw radioimmunologiczny Ausria II, HBe, Havab-M i Anti-Delta, Abbott, North Chicago). IgM anty-HBc badano za pomocą testu radioimmunologicznego (zestaw testów radioimmunologicznych klasy IgM anty-HBc, Dainabbott, Tokio). Wirusa przeciw wirusowi zapalenia wątroby typu C badano metodą immunoenzymatyczną (Ortho Diagnostics, Tokio).
DNA HBV ekstrahowano ze 100 .l surowicy i wykryto metodą hybrydyzacji punktowej, jak opisano poprzednio.14 Pozytywne sygnały radioaktywne na bibułach nitrocelulozowych oceniono jako półilościowe jako 1+ (0,5 do 20 .g), 2+ (21 do 100 .g) i 3+ (więcej niż 100 pg).
Amplifikacja i sekwencjonowanie regionu Precore DNA HBV
Rysunek 1. Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie Precore i rdzeniowych regionów genomu HBV. Region rdzeniowy (nukleotydy od 1901 do 2458) koduje 183 reszty aminokwasowe białka nukleokapsydu i jest poprzedzony regionem pierwotnym (nukleotydy 1814 do 1900), który koduje 29 reszt aminokwasowych.15 Ponieważ geny prekod i rdzeniowe mają w fazie otwartej ramki odczytu, otwarta ramka odczytu zaczynająca się od nukleotydu 1814 może kodować prekursorowy i rdzeniowy peptyd, który jest przetwarzany w celu wytworzenia HBeAg w retikulum endoplazmatycznym. Ponieważ hydrofobowa domena prekursorowego peptydu działa jako sekwencja liderowa do kotwiczenia peptydu do błony retikulum endoplazmatycznego, mutacja kodonu stop (nukleotyd 1896) w regionie przedwzmacniacza (strzałka) będzie zakłócać tworzenie HBeAg.
W celu amplifikacji regionu wyjściowego DNA HBV, przygotowaliśmy dwie pary syntetycznych starterów oligonukleotydowych: F1 (nukleotydy 1744 do 1761) i F2 (nukleotydy 1940 do 1959) do amplifikacji segmentu precore genomu HBV i S1 (nukleotydy 1774 do 1792 ) i S2 (nukleotydy 1916 do 1932) do dwukierunkowego sekwencjonowania amplifikowanego segmentu precore w genomie HBV.
W celu amplifikacji segmentu DNA HBV, przygotowaliśmy parę syntetycznych starterów oligonukleotydowych zgodnie z sekwencją opisaną przez Ono i wsp. 15: nukleotydy 1744 do 1761 (5 GGGAGGAGATTAGGTTAA3 ) i nukleotydy 1940 do 1959 (5 GGCAAAAA- (A / C) GAGAGTAACTC3 ) (fig. 1). Za pomocą tych starterów, segment DNA HBV obejmujący 216 nukleotydów (od 1744 do 1959), który stanowi cały region przedwzmacniacza, został zamplifikowany przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR). 16 Te primery zsyntetyzowano za pomocą syntetyzatora DNA (model 380A , Applied Biosystems, Foster City, CA) zgodnie z metodą fosforoamidytową i oczyszczony za pomocą wysokowydajnego systemu rozdziału chromatografu cieczowego (model 152A, Applied Biosystems).
Amplifikację DNA HBV przeprowadzono zgodnie z metodą Saiki i wsp.16. W skrócie, 100 .l mieszanin reakcyjnych zawierających 10 .l DNA próbki, 50 mM chlorku potasu, 10 mM kwasu TRIS-chlorowodorowego (pH 8,4), 2,5 mM magnezu chlorek, .M każdy z dwóch starterów oligonukleotydowych, 200 .M dNTP, 200 .g żelatyny na mililitr i 2 jednostki polimerazy Taq (New England Biolabs, Beverly, MA) nakładano na 100 .l oleju mineralnego
[podobne: poradnia endokrynologiczna dla dzieci, nfz bydgoszcz ekuz, przychodnia mswia warszawa ]